肝细胞癌（以下简称肝癌）是世界常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌患者病死率在世界上占较高比例，癌细胞肝内转移是患者术后复发的重要原因[1-2]。细胞增殖和凋亡调控的失衡是引起肿瘤发生发展的重要原因[3]；肝癌细胞的迁移、侵袭是导致癌其转移的重要因素[4]。然而，介导肝癌增殖、迁移、侵袭和凋亡的潜在分子机制尚未完全不清楚。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度＞200 nt的非编码RNA，其可通过多种方式发挥其生物学功能，研究[5-7]表明lncRNA可以作为一种竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用，参与调控靶基因的表达，在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。大量研究[8-10]表明，lncRNA在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，可调控细胞增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭等过程。既往研究发现敲除lncRNACASC15可以通过Y染色体上的性别决定区相关高迁移率族盒蛋白4（sexdertermining region of Y chromosome related high mobility group box 4，SOX4）/Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路明显抑制肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭，并在体外促进细胞凋亡[11]。沉默lncRNA LEF1-AS1可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，且可抑制体内肿瘤的生长[12]。RUSC1-AS1是一个新发现的肿瘤相关的lncRNA，研究[13]表明RUSC1-AS1在乳腺癌组织中高表达，其表达水平与肿瘤大小和临床等级呈正相关，而与患者的整体生存呈负相关；沉默RUSC1-AS1显著抑制了乳腺癌MCF-7和BT549细胞的活力、克隆能力及细胞周期进程并诱导了其凋亡。RUSC1-AS1在喉鳞状细胞癌中上调表达，非甲基化可调节RUSC1-AS1的表达，且RUSC1-AS1与可能是喉鳞状细胞癌的重要预后生物标志物[14]。然而lncRNA RUSC1-AS1在肝癌中的表达和功能国内外尚未见报道。笔者前期采用Starbase预测显示，lncRNA RUSC1-AS1和微小RNA-326（miR-326）存在结合位点。因此，本研究检测lncRNA RUSC1-AS与miR-326在肝癌及癌旁组织中的表达，通过分子生物学实验分析lncRNA RUSC1-AS表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其与miR-326的关系。
1 材料与方法
1.1 一般资料
收集2017年1月—2019年12月收治的肝癌患者经手术切除的肝癌组织及对应的癌旁组织（距离肿瘤边缘2～5 cm）标本41例，其经病理检测确认为肝癌，患者手术前未进行过手术及放化疗，所有患者均知情且签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会审核批准。
1.2 主要材料
肝癌MHCC97-H细胞购自美国ATCC；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；TRIzol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本Takara公司；Lipofectamine TM 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；miR-326模拟物/抑制物、lncRNA RUSC1-AS1表达抑制质粒及各自阴性对照购自广州锐博生物技术有限公司；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒购自武汉益普生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液购自北京百奥莱博科技有限公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购自美国Bio-world公司；聚偏二氟乙烯膜购自美国Millipore公司；ECL发光液购自美国Advansta公司；cyclin D1抗体购自美国Biorbyt公司；P21、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、GAPDH抗体购自美国Abbiotec公司；Transwell小室、Matrigel胶购自美国BD公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒购自上海BestBio贝博生物公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；荧光素酶报告载体购自江苏百奥迈科生物技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养与分组 肝癌MHCC97-H 细胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养液在37 ℃、5% CO2 条件下培养，2 d 换液1 次，待细胞融合至80%～90% 左右时，用胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期细胞进行实验。取对数生长期MHCC97-H 细胞，按照每孔2×105 个细胞接种于六孔板中，待细胞贴壁后根据LipofectamineTM 2000 说明书进行转染，将lncRNA RUSC1-AS1表达抑制质粒（si-RUSC1-AS1 组）/ 阴性对照质粒（si-NC 组）、miR-326 模拟物（miR-326组）/ 阴性对照序列（miR-NC 组）分别转染至MHCC97-H 细胞中；将lncRNA RUSC1-AS1 表达抑制质粒分别与miR-326 抑制物（si-RUSC1-AS1+anti-miR-326 组）及其阴性对照序列（si-RUSC1-AS1+anti-miR-NC 组）转染至MHCC97-H细胞中。
1.3.2 qRT-PCR 检测lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 的表达水平 用TRIzol 试剂提取组织和细胞中的总RNA，将RNA 反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3 个重复，循环条件为95 ℃ 5 min，95℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40 个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct 法计算。lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 分别以GAPDH 和U6 为内参，lncRNA RUSC1-AS1 上游引物序列：5'-CAG GGT CCC ACT ATG TTG CT-3'，下游引物序列：5'-CCA TTT TAT AGG CGG GGA GT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGT TGC CAT CAA TCA CCC CTT-3'，下游引物序列：5'-CTC CAC GAC GTA CTC AGCG-3'；miR-326 上游引物序列：5'-CAT CTG TCT GTT GGG CTG GA-3'，下游引物序列：5'-AGG AAG GGC CCA GAG GCG-3'；U6 上游引物序列：5'-CGG GTT TGT TTT GCA TTT CT-3'，下游引物序列：5'-AGT CCC AGC ATG AAC AGC TT-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。
1.3.3 MTT 法检测细胞增殖 取对数生长期MHCC97-H 细胞，按照每孔5×104 个细胞接种于六孔板中，在各组细胞培养至24、48、72 h时，每孔分别加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，于培养箱中继续孵育4 h 后弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡反应10 min 使沉淀溶解，用酶标仪于波长450 nm 处检测吸光度（OD）值。
1.3.4 Western blot 法检测cyclin D1、P21、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax 蛋白表达 用RIPA 蛋白裂解液提取细胞总蛋白，用BCA 试剂盒进行蛋白定量。各组蛋白上样量60 μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经电转将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上。用5% 脱脂牛奶室温封闭90 min，分别加入相应的一抗（1:800），4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3 次，每次5 min；再加入二抗（1:1 200）室温孵育2 h，PBS 洗涤3 次，每次10 min，后在暗室中用ECL 发光液显影，用ChemiDoc XRS+ 系统成像，再用Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。
1.3.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 细胞迁移实验：分别将600 μL 含胎牛血清的RPMI-1640 完全培养液和200 μL 细胞悬液加入Transwell 小室的下室和上室中，放入细胞培养箱中培养24 h。取出小室，吸去培养液后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并拍照，计算结晶紫染色细胞数即为迁移细胞数。细胞侵袭实验：将60 μL Matrigel 与300 μL 无血清的RPMI-1640培养液中混匀，然后取100 μL 平铺于Transwell小室的上室，凝固后按细胞迁移实验操作进行。
1.3.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取转染48 h 后生长状态良好的细胞，吸弃上清液，PBS 漂洗细胞2 次，吸弃PBS 液，加1～2 mL 胰酶消化细胞使之脱壁，静置5～8 min，轻摇使之形成均匀细胞悬液，结合缓冲液终止消化，分别加annexin V-FITC和PI 各5 μL，轻摇混匀，常温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3 个复孔，实验重复3 次。
图1 qRT-PCR 检测结果
Figure 1 Results of qRT-PCR detection
A：lncRNA RUSC1-AS1 在肝癌组织中的表达；B：miR-326 在肝癌组织中的表达
A:Expression of lncRNA RUSC1-AS1 in HCC tissues;B:Expression of miR-326 in in HCC tissues
1.3.7 荧光素酶报告实验检测lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 的靶向关系 构建lncRNA RUSC1-AS1 的野生型和突变型的荧光素酶表达载体质粒WT-RUSC1-AS1 和MUT-RUSC1-AS1，用LipofectamineTM 2000 将WT-RUSC1-AS1 和MUTRUSC1-AS1 质粒分别与miR-326 模拟物及相应的对照序列共转染至293T 细胞中。转染48 h 后按照说明书检测荧光素酶活性。
1.4 统计学处理
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（
±s）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 lncRNA RUSC1-AS1 和miR-326 在肝癌组织中的表达
应用qRT-PCR检测41例肝癌组织和癌旁组织中lncRNA RUSC1-AS1和miR-326的表达水平，结果显示，与癌旁组织比较，肝癌组织中RUSC1-AS1表达水平明显升高，miR-326表达水平明显降低（均P＜0.05）（图1）。
2.2 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达对MHCC97-H 细胞增殖的影响
与si-NC组比较，si-RUSC1-AS1组MHCC97-H细胞中RUSC1-AS1表达水平明显降低，24、48、72 h细胞OD值明显降低，cyclin D1蛋白表达水平明显降低，P21 蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05）（图2）。
图2 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达对MHCC97-H 细胞增殖的影响
Figure 2 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference on proliferation of MHCC97-H cells
A：lncRNA RUSC1-AS1 相对表达量；B：细胞增殖曲线；C：增殖相关蛋白的表达
A:Relative expression levels of lncRNA RUSC1-AS1;B:Cell proliferation curves;C:Expression levels of the proliferation-associated proteins
2.3 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达对MHCC97-H细胞迁移、侵袭的影响
与si-NC组比较，si-RUSC1-AS1组MHCC97-H细胞迁移、侵袭数明显降低，MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显降低（均P＜0.05）（图3）。
图3 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达对肝癌MHCC97-H 细胞迁移、侵袭的影响
Figure 3 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference on migration and invasion of MHCC97-H cells
A：Transwell 实验结果；B：迁移侵袭相关蛋白表达
A:Results of Transwell assay;B:Expression levels of the migration- and invasion-related proteins
2.4 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达对MHCC97-H细胞凋亡的影响
与si-NC组比较，si-RUSC1-AS1组MHCC97-H细胞凋亡率明显升高，Bcl-2蛋白表达水平明显降低，Bax蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05） （图4）。
图4 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达对肝癌MHCC97-H 细胞凋亡的影响
Figure 4 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference on apoptosis of MHCC97-H cells
A：流式细胞术检测结果；B：凋亡相关蛋白表达
A:Results of flow cytometry analysis;B:Expression levels of apoptosis-related proteins
2.5 miR-326 过表达对MHCC97-H 细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响
与miR-NC组比较，miR-326组MHCC97-H细胞中miR-326表达水平明显升高，24、48、72 h细胞OD值明显降低，细胞迁移、侵袭数明显降低，细胞凋亡率明显升高，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平明显降低，P21、Bax蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）（图5）。
2.6 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达同时抑制miR-326 表达对MHCC97-H 细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的作用
与si-RUSC1-AS1+anti-miR-NC组比较，si-RUSC1-AS1+anti-miR-326组MHCC97-H细胞中miR-326表达水平明显降低，24、48、72 h细胞OD 值明显升高，细胞迁移、侵袭数明显升高，细胞凋亡率明显降低，cyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平明显升高，P21、Bax蛋白表达水平明显降低（均P＜0.05）（图6）。
图5 miR-326 过表达对肝癌MHCC97-H 细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响
Figure 5 Influence of miR-326 overexpression on proliferation,migration,invasion and apoptosis of MHCC97-H cells
A：miR-326 相对表达量；B：细胞增殖曲线；C：Transwell 实验结果；D：流式细胞术检测结果；E：增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白的表达
A:Relative expression levels of miR-326;B:Cell proliferation curves;C:Results of Transwell assay;D:Results of flow cytometry analysis;E:Expression levels of proteins associated with proliferation,migration,invasion and apoptosis
图6 干扰lncRNA RUSC1-AS1 表达同时抑制miR-326 表达对MHCC97-H 细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的作用
Figure 6 Influence of lncRNA RUSC1-AS1 interference with miR-326 inhibition on proliferation,migration,invasion and apoptosis of MHCC97-H cells
A：miR-326 相对表达量；B：细胞增殖曲线；C：Transwell 实验结果；D：流式细胞术检测结果；E：增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白的表达
A:Relative expression levels of miR-326;B:Cell proliferation curves;C:Results of Transwell assay;D:Results of flow cytometry analysis;E:Expression levels of proteins associated with proliferation,migration,invasion and apoptosis
2.7 lncRNA RUSC1-AS1 靶向调控miR-326 的表达
StarBase在线软件预测显示lncRNA RUSC1-AS1与miR-326存在互补的核苷酸序列（图7A）。在MHCC97-H细胞中共转染miR-326模拟物或阴性对照序列和WT-RUSC1-AS1或MUT-RUSC1-AS1，双荧光素酶报告实验结果显示（图7B），过表达miR-326明显降低包含WT-RUSC1-AS1质粒的荧光素酶活性（P＜0.05），但不影响包含MUTRUSC1-AS1质粒的荧光素酶活性（P＞0.05）。qRT-PCR检测测转染lncRNA RUSC1-AS1过表达质粒、干扰质粒或阴性对照序列的MHCC97-H细胞中miR-326 表达水平，结果显示，过表达RUSC1-AS1导致miR-326表达水平明显降低，抑制RUSC1-AS1表达导致miR-326表达水平明显升高（均P＜0.05）（图7C）。
图7 lncRNA RUSC1-AS1 与miR-326 的关系分析
Figure 7 Analysis of relationship between lncRNA RUSC1-AS1 and miR-326
A：lncRUSC1-AS1 的序列中含有与miR-326 互补的核苷酸序列；B：双荧光素酶报告实验结果；C：lncRNA RUSC1-AS1 调控miR-326 的表达
A:Complementary nucleotide sequence of miR-326 in lncRUSC1-AS1 sequence;B:Results of luciferase report assay;C:Regulatory effect of lncRNA RUSC1-AS1 on miR-326 expression
3 讨 论
越来越多的研究[15-17]表明lncRNA在肝癌的发生发展中发挥重要的作用，其可能通过调控抑癌或致癌基因起作用。因此，研究影响肝癌的lncRNA对于揭示肝癌发生发展的分子机制至关重要。已有大量研究表明多种lncRNA影响肝癌的进展，如lncRNA LBX2-AS1通过充当miR-384的竞争内源RNA，从而上调胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS1）的表达来驱动肝癌的发展；敲低lncRNA LBX2-AS1会减弱肝癌细胞增殖，迁移和侵袭，并在体外诱导其凋亡[18]。LINC01139通过与miR-30家族竞争性结合，通过上调成髓细胞瘤转录因子第2亚型（MYB protooncogene like 2，MYBL2）来促进肝细胞癌的发展；LINC01139可能成为肝癌患者的潜在治疗靶点和预后生物标志物[19]。近年来研究表明lncRNA RUSC1-AS1在人类肿瘤中起重要作用，已有研究[13-14]报道lncRNA RUSC1-AS1在乳腺癌、喉鳞状细胞癌中具有致癌作用。且有研究[20]报道lncRNA RUSC1-AS1在宫颈癌组织和细胞系中高表达，RUSC1-AS1的高表达与宫颈癌患者的FIGO分期，淋巴结转移和较短的总生存期显著相关；干扰lncRNA RUSC1-AS1表达通过上调miR-744抑制了宫颈癌细胞的体外增殖，迁移和侵袭，诱导细胞凋亡；并阻碍体内肿瘤的生长。然而目前lncRNA RUSC1-AS1在肝癌发生发展中的作用尚不清楚。本研究重点研究lncRNA RUSC1-AS1在肝癌组织中的表达，并进一步探究lncRNA RUSC1-AS1对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其潜在的作用机制。
本研究首先在20例肝癌组织和对应的癌旁组织中检测lncRNA RUSC1-AS1的表达差异，结果发现lncRNA RUSC1-AS1在肝癌组织中的表达水平显著高于对应的癌旁组织，表明lncRNA RUSC1-AS1在肝癌组织可能起促癌作用，与在其他癌症中的作用相同。功能试验发现干扰lncRNA RUSC1-AS1表达后，肝癌MHCC97-H细胞在培养至24、48、72 h时细胞OD值显著降低，细胞迁移、侵袭数显著降低，细胞凋亡率显著升高，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，P21、Bax蛋白表达水平显著升高。cyclin D1、P21是细胞周期相关蛋白，其表达水平与细胞增殖有关，cyclin D1是正调控因子，P21是负调控因子，cyclin D1低表达，P21高表达抑制细胞增殖[21]。MMP-2、MMP-9 是基质金属蛋白酶家族成员，其高表达可降解细胞外基质，促进细胞迁移、侵袭[22]。Bcl-2、Bax是调控细胞凋亡的关键因子，Bcl-2是抗凋亡因子，Bax是促凋亡因子，其表达水平可反映细胞凋亡情况[23]。表明干扰lncRNA RUSC1-AS1表达可显著抑制MHCC97-H细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。
研究[24-27]表明miRNA也参与调控肝癌细胞的发生发展过程，影响癌细胞的增殖、凋亡、转移等。有研究[28]报道miR-326在肝癌组织和细胞系中下调表达，miR-326的低表达与肝癌患者的TNM分期，分化和淋巴结转移密切相关；miR-326过表达通过直接靶向LIM和SH3蛋白1（LIM and SH3 protein 1，LASP1）在体外抑制了肝癌细胞的增殖和侵袭，并激活了细胞凋亡。还有研究[29]表明miR-326过表达可显著抑制前列腺癌细胞增殖，集落形成，迁移和侵袭，诱导G0/G1细胞周期阻滞并促进前列腺癌细胞凋亡。上调miR-326显著抑制了乳腺癌细胞生长和集落形成，且阻滞了细胞周期，并诱导了细胞凋亡[30]。本实验结果显示，与癌旁组织相比，miR-326在肝癌组织中表达水平显著升高。过表达miR-326后，肝癌MHCC97-H细胞培养至24、48、72 h时细胞OD值显著降低，细胞迁移、侵袭数显著降低，细胞凋亡率显著升高，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，P21、Bax蛋白表达水平显著升高。说明过表达miR-326可显著抑制MHCC97-H细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。
为进一步研究lncRNA RUSC1-AS1对肝癌细胞的影响的机制是否与miR-326有关，本实验通过StarBase在线软件预测可能与lncRNA RUSC1-AS1结合的miRNA，结果发现lncRNA RUSC1-AS1与miR-326存在结合位点，双荧光素酶报告实验结果证实lncRNA RUSC1-AS1可靶向miR-326。且过表达lncRNA RUSC1-AS1导致miR-326表达水平显著降低，抑制lncRNA RUSC1-AS1表达导致miR-326表达水平显著升高，表明lncRNA RUSC1-AS1确实可调控miR-326的表达。研究报道lncRNA可通过调控miR-326表达影响肿瘤进展，如lncRNA DDX11-AS1通过调节miR-326/IRS1轴促进胃癌的细胞进程和奥沙利铂耐药性[31]。lncRNA TDRG1通过靶向miR-326调节子宫颈癌中丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）的表达来促进细胞增殖、迁移和侵袭[32]。LncRNA SNHG3通过靶向miR-326促进肝细胞肿瘤的发 生[33]。lncRNA H19可以作为ceRNA海绵来修饰miR-326并调节TWIST1表达参与肝细胞癌的发展[34]。本实验结果显示，抑制miR-326表达的同时干扰lncRNA RUSC1-AS1表达，培养24、48、72 h后细胞OD值显著升高，且细胞迁移、侵袭数显著升高，细胞凋亡率显著降低，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平显著升高，P21、Bax蛋白表达水平显著降低。说明抑制miR-326表达可能逆转了干扰lncRNA RUSC1-AS1表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡促进作用。
综上所述，肝癌组织中lncRNA RUSC1-AS1异常高表达，干扰lncRNA RUSC1-AS1表达可能通过上调miR-326表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。lncRNA RUSC1-AS1的异常高表达可能是促进肝癌进展的驱动因素，其可作为生物治疗肝癌的潜在作用靶点。
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