环状RNA与甲状腺癌关系的研究进展

甲状腺癌（thyroid carcinoma）是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%，近年来其发病率在世界各地稳步增长，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）发病率的增长速度最快，平均发病年龄更年轻[1-2]。PTC是起源于甲状腺滤泡上皮细胞的分化型甲状腺癌，是甲状腺癌的最常见病理类型，占所有甲状腺癌的85%～95%[3-4]。目前PTC的诊断主要依靠病史、专科查体、颈部超声及超声引导下细针穿刺细胞学活检（fine needle aspiration，FNA）等检查[5]。PTC大致可分为惰型和侵袭型两种类型，惰型病程进展缓慢，表现高度惰性，5年生存率＞95%，预后良好，但侵袭型PTC，例如伴有高龄，多灶性肿瘤，腺外侵犯，淋巴结转移和远处转移特征的PTC可分化为更具致命性的甲状腺癌，对手术、131I治疗及术后TSH抑制治疗等传统治疗效果不理想[6]。目前研究认为，PTC的发生与BRAF基因、RAS基因等癌基因的异常激活及P53抑癌基因失活密切相关，近年来因高通量RNA测序的出现，发现一些非编码RNA，如微小RNA（microRNA，miRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）在甲状腺癌中表达异常。

1 circRNA概述

circRNA是一类非编码RNA，最初认为mRNA前体剪接错误产生的无功能副产物，然而随着RNA测序技术的发展及高通量RNA测序的出现，发现其在多个细胞系中以及不同生物物种中存在，并根据不同的细胞类型，组织和发育阶段显示特定的表达模式，于1976年Sanger首次在病毒中发现[7-8]。circRNA是通过一种名为从“尾”到“头”的反剪接机制产生的，即将基因3'端的外显子反剪接到基因5'端的外显子上，结合形成连续闭环的单链非编码RNA分子[9]。根据circRNA来源，可大致分为3类，包括外显子circRNA，内含子circRNA以及外显子和内含子基因间circRNA[10-11]。与传统的线性RNA相比，circRNA是共价闭合的连续环，没有5'-3'端极性，无5'端帽子结构和3'端聚腺苷酸尾巴，也没有蛋白质编码能力[12-13]。circRNA参与疾病调控的机制通常包括：⑴ 作为内源性RNA的一部分即“miRNA海绵”调节靶基因表达；⑵ 调节RNA聚合酶II转录物的活性；⑶ 调节RNA结合蛋白；⑷ 与核糖体结合参与蛋白质的翻译[14-15]。

2 circRNA与甲状腺癌的关系

2.1 circRNA在甲状腺癌发生、发展中的作用及机制

circRNA_RAPGEF5主要位于细胞核的7号染色体上，基因组长度为26 863 bp，剪接后的成熟序列长度为516 bp，由RAPGEF5基因的5个外显子组成。circRNA_RAPGEF5在PTC组织和细胞系中表达上调，表达上调的circRNA_RAPGEF5通过与下游靶标miRNA-198结合使miRNA-198表达受抑，进而上调下游靶基因成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）的表达，促进上皮间质转换（epithelial mesenchymal transition，EMT），从而促进细胞的增殖，迁移和侵袭而抑制细胞凋亡[16]。circRNA_0025033位于12号染色体上，是转录因子叉头框1（FOXM1）基因的转录产物，circRNA_0025033在PTC组织和细胞中表达增加，而下游靶标miRNA-1231和miRNA-1304则表达减少，进一步研究发现，circRNA_0025033通过与miRNA-1231和miRNA-1304靶向结合使其表达下调，从而促进PTC细胞的增殖，迁移并抑制细胞凋亡[17]。

circRNA_0004458位于8号染色体上，由PSD3-mRNA的第5外显子和第8外显子剪接形成，基因组长度为448 bp，最佳转录本为NM_015310，最早在胃癌中发现[18]，circRNA_0004458在PTC组织和细胞中表达上调且miRNA-885-5p是circRNA_0004458的直接靶标，而RAC1蛋白是miR-885-5p的下游靶标，RAC1蛋白是一种细胞内信号分子，属于Rho家族小G蛋白，在各种蛋白激酶的细胞生长，骨架形成，迁移，侵袭和激活中起着关键作用[19]。circRNA_0004458通过靶向结合miRNA-885-5p上调RAC1的表达，从而促进PTC的增殖，并抑制细胞周期停滞和凋亡，相反circ_0004458的沉默则抑制PTC的生长并诱导PTC细胞周期阻滞和凋亡，且circRNA_0004458的表达水平与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移、远处转移、和TNM分期密切相关[20]。circRNA-NEK6是一种编码NEK6-mRNA的外显子circRNA，MiRNA-370-3p和人类卷曲蛋白8（FZD8）是其下游通路中的靶基因，circRNA-NEK6通过减少MiRNA-370-3p的表达而增加FZD8的表达并激活Wnt信号通路，进而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，而抑制凋亡[21]。

2.2 circRNA在甲状腺癌中的表达及其与临床病理的关系

2.2.1 表达上调的circRNA Wei等[22]采用qRT-PCR技术检测了41对PTC组织及癌旁正常组织的circ_ZFR表达，发现circ_ZFR在PTC组织中表达上调，其中III～IV期标本的circ_ZFR的表达显著高于I～II期的标本，伴有转移标本的circ_ZFR表达比非转移样本的表达高，原因为circ_ZFR通过充当下游靶基因miRNA-1261的“miRNA海绵”，靶向结合C8ORF4蛋白的3'-非翻译区，使C8orf4蛋白表达上调，从而促进PTC细胞的的增殖，迁移和侵袭，因此，circ_ZFR在PTC的发生发展中起致癌基因的作用。Wang等[23]报道发现circ_0067934在甲状腺癌组织和细胞中表达上调，且circ_0067934的表达水平与肿瘤大小，淋巴结转移、AJCC分期呈正相关，而与患者生存率呈负相关，和年龄、性别没有相关性，circRNA_0067934通过激活EMT和PI3K/Akt信号通路，调控细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡，是甲状腺癌预后的独立危险因素。Liu等[24]分析发现，circ_0011385在PTC组织中表达上调，circ_0011385通过与miRNA-204-CDH2或miRNA-6777-VC靶向结合，在此基础上通过参与p53信号通路，细胞黏附分子途径等方式参与甲状腺癌的发生发展。

血清外泌体呈囊状，带有双膜，直径约100 nm，内含转运蛋白，主要存在于大多数细胞的小内分泌囊泡内[25]。相关研究发现外泌体中circRNA的浓度高于正常细胞的circRNA浓度，且外泌体中的circRNA可以反映细胞和组织中circRNA的水平[26]。Yang等[27]应用高通量测序从PTC患者血清中筛选出22个差异表达的circRNA，其中3个circRNA表达上调，19个circRNA表达下调，这些差异表达的circRNA通过参与甲状腺激素信号通路、PI3K/Akt信号通路、5'-单磷酸腺苷AMPK信号通路和磷脂酰肌醇信号通路等16条信号通路参与PTC的发生发展。因此对血清外泌体中circRNA的表达进行检测，有望成为PTC的潜在诊断及治疗的分子生物标志物。Lan等[28]从90对PTC及癌旁正常甲状腺组织行微阵列分析，发现87个显著差异性表达的circRNA，其中41个表达上调，46个表达下调；在这些差异表达的circRNA中，外显子circRNA 70个，内含子circRNA 7个；基因间circRNA 1个，其余9个来自转录重叠区域，并且这些差异表达的circRNA通过调控亲本基因的表达参与PTC的发生发展。甲状腺球蛋白（TG）是甲状腺激素合成的基质，对甲状腺激素的合成和分泌具有调节作用，TG的突变是导致先天性甲状腺功能减低症的重要原因之一。Teng等[29]研究了circRNA与TG之间的关系，发现在TG中circTG1-circTG6等6个circRNA的突变与PTC的不良预后显着相关，且同一供体circRNA具有不同的受体，同一宿主基因的不同环状RNA其表达谱具有差异性。

2.2.2 表达下调的circRNA circ_0137287基因位于8号染色体上，长度为284 bp，基因符号为SLC26A7，主要存在于哺乳动物的大脑中[30]。Lan等[31]报道circ_0137287在PTC组织及细胞中表达下调，且表达下调的circ_0137287与PTC的腺外侵犯，淋巴结转移，晚期T期和肿瘤大小等侵袭性临床病理特征密切相关，尤其与肿瘤大小之间呈负相关，但与其他临床病理参数（例如年龄，性别，TNM分期和肿瘤数量）之间没有相关性，circ_0137287可作为PTC的诊断、腺外侵犯及淋巴结转移的标志物，其敏感度和特异度分别为79.2%、90.0%、64.1%和65.4%、89.3%、38.9%。Ren等[32]对PTC和与之相匹配的非癌甲状腺组织进行了circRNA微阵列分析，共鉴定出206个上调的circRNA和177个下调的circRNA，其中上调和下调最明显的是circRNA_007148和circRNA_047771，且circRNA_047771的低表达与BRAFV600突变，淋巴结转移以及晚期TNM分期呈负相关，而与其他临床病理因素（包括年龄，性别，桥本甲状腺炎的病史），甲状腺影像报告和数据系统（TI-RAIDS），肿瘤大小和多灶性无关，相反circRNA_007148的高表达与淋巴结转移呈正相关。Peng等[33]通过微阵列分析和qRTPCR验证发现，与良性甲状腺组织相比，PTC组织中circRNA_104566等12个circRNA表达明显上调，而circRNA_100777、circRNA_104348、circRNA_103454、circRNA_100395等4个circRNA表达显著下调，进一步研究发现表达下调的circRNA_100395通过与下游靶标miR-141-3p/miR-200A-3p相互作用参与PTC的发生发展。

2.3 circRNA通过调控相关信号通路中的靶基因的表达、参与甲状腺癌的发生发展

Wnt/β-catenin信号传导通路是涉及肿瘤发生的经典途径，Wnt/β-catenin通路的异常激活通常会导致多种癌症的发展，例如重组人β-连环素蛋白互作蛋白1（CTNNBIP1）是β-连环蛋白（β-catenin）的相互作用蛋白，对Wnt/β-catenin通路具有负调控的作用[34]。Bi等[35]发现circRNA_102171在PTC组织和细胞中高表达，circRNA_102171通过与CTNNBIP1相互作用，阻止CTNNBIP1与β-catenin/TCF3/TCF4/LEF1复合物的结合，而促进β-catenin与TCF蛋白结合形成β-catenin/TCF复合物启动转录，从而激活Wnt/β-catenin通路，促进甲状腺甲状腺癌的进展。敲除circRNA_102171能促进β-catenin与CTNNBIP1之间的相互作用，抑制Wnt /β-catenin通路的靶基因CCND1，CCND2，MYC和SOX4的表达，抑制PTC细胞的增殖、迁移和侵袭，同时诱导细胞凋亡。Wang等[36]报道发现circRNA-ITCH在PTC组织和细胞中表达下调，且miR-22-3p是circRNAITCH和CBLmRNA的共同靶基因，circRNA-ITCH通过与miR-22-3p靶向结合后促使核b-连环蛋白的E3连接酶（CBLmRNA）表达上调，从而抑制Wnt/b-catenin通路的靶基因（MYC、CCND1、SOX4）的表达并促进b-catenin的降解，抑制PTC的侵袭和转移，在甲状腺癌的进展中扮演着抑癌基因的作用。

单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一种重要的细胞内信号通路，主要通过p53依赖方式对细胞周期进行调控，是一种肿瘤抑制激酶，对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）起负调控作用[37]。mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是调节细胞生长、存活和运动的重要调节因子，mTOR的异常激活能抑制细胞自噬并增强细胞生长和增殖[38]。circRNA_0008274位于11号染色体上，基因符号为UGGT2。circRNA_0008274在PTC组织和细胞系中表达上调，circRNA_0008274通过抑制p-AMPK信号通路的激活并促进p-mTOR的表达，激活AMPK/mTOR信号通路，进而促进PTC细胞的增殖、侵袭及转移并抑制凋亡，此外circRNA_0008274的表达与TNM分期和淋巴结转移呈正相关，而与年龄，性别，甲状腺腺外侵犯，原发肿瘤位置和肿瘤大小无关[39]。由notch受体、notch配体及notch的调节分子等组成的notch通路在生物进化中高度保守，能通过对肿瘤微环境、血管生成、上皮间质转换、侵袭转移等的调控参与肿瘤的发生进展[40]。circRNA_0058124位于2号染色体上，长度为864 bp，由纤连蛋白1基因组的5个外显子组成，在肿瘤较大、甲状腺腺外侵犯、淋巴结转移或远处转移的PTC患者中的表达水平显著增高，而与年龄、性别及病灶数量之间没有相关性，circ_0058124通过作为miRNA-218-5p的“miRNA海绵”上调靶基因numb的表达，而numb是notch通路的一个强有力的抑制因子，因此上调的numb抑制notch3/gatad2A通路的激活，增强PTC细胞的增殖，迁移和侵袭并抑制凋亡，在甲状腺癌的进展中扮演着癌基因启动子的作用[41]。

3 展望

circRNA在甲状腺癌中表达紊乱。了解甲状腺癌中特异性circRNA表达谱的变化及其生物学功能的差异，有望应用于甲状腺癌的早期诊断、鉴别诊断、高危人群的普查、肿瘤预后评价、预测肿瘤转移和复发。相信随着新一代测序技术与基因芯片技术的广泛应用，将有助于更加全面真实地揭示circRNA的功能和作用机制，也为甲状腺癌的无创诊断、靶向治疗提供新的思路及依据。

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